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富血小板纤维蛋白在口腔种植学中的应用进展

2019-7-13 17:07  来源:口腔医学
编辑:吴岸谦 于洪强 丁鑫鑫 周延民 阅读量:3113

    富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)作为第二代血小板浓缩制品相比于第一代人工血小板制品由于不含人工添加剂,避免了免疫排斥反应,在临床上得到了广泛运用。PRF由Choukroun于2000年首次发现:血液在10mL离心管内通过3000r/min,10min离心后分层,PRF位于血浆层和红细胞层之间。PRF中含有大量的血小板,血小板大多聚集在红细胞层和PRF层交界处。血小板α颗粒中含多种蛋白,其磷脂双分子层中嵌入多种蛋白的受体,同时,血小板内也富含多种细胞因子。

    在口腔种植领域中,PRF作为修复软硬组织缺损的良好自体材料越来越多地被应用于种植手术时引导组织再生的相关术式中。

    1.PRF的组成

    PRF内主要成分为纤维蛋白,纤维蛋白构成的支架中网罗了大量血小板,而血小板内富含多种生长因子。以下多种成分构成了PRF。

    1.1纤维蛋白

    PRF主要的支架成分为纤维蛋白,它较其他的血小板浓缩制品含有更多的纤维蛋白、纤连蛋白及玻连蛋白。血小板大量的位于纤维网之间,PRF内的三分子等边纤维蛋白的连接使PRF具有很大的灵活性,既可以捕获血液中的细胞因子和迁移的细胞,又可以缓慢地将它们释放。这些PRF内富含的生长因子通过与特异性的细胞膜受体结合来发挥调节作用,促进组织的生长与愈合。同时,PRF中的蛋白酶可以通过降解细胞外纤维蛋白基质来调节生长因子的活动。

    1.2细胞因子

    PRF内存在多种细胞因子,如转化生长因子-beta(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等,同时也包括一些炎症因子如白细胞介素-1β、4、6(IL-1β、4、6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等,他们的存在对于PRF促进成骨发挥着非常重要的作用。TGF-β家族的成员超过40种,包括TGF-βs、激活素、骨形态发生蛋白(BMPs)等。

    目前已知TGF-βs包括TGF-β1-β5,BMPs包括BMP1-16。经典的TGF-β通路通过细胞膜上特定的Ⅰ型和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的跨膜异二聚体复合物来传递信号。Ⅰ类受体在Ⅱ型受体激活后会发生磷酸化。活化的Ⅰ类受体使得受体调节Smad蛋白(R-Smad)Smad2/3磷酸化从而被激活。激活后的Smad2/3与Smad4形成复合物,进而转导信号至细胞核内促进成骨。

    经典的BMP信号通路通过结合Ⅱ型受体从而激活Ⅰ型受体使其磷酸化,活化的Ⅰ型受体通过脂筏中再生蛋白调控激活BMP相关的受体调节蛋白Smad1/5/8,而后磷酸化的受体调节蛋白与Smad4形成共聚物从而将信号转运至细胞核内。通过这些通路TGF-β可以促进间充质干细胞的增殖与早期分化,促进骨祖细胞的富集,并参与早期骨的生成。PDGF是一个包含五种异/同型二聚体的蛋白家族(PDGF-AB、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD)。PDGF可以直接调节间充质干细胞的有丝分裂;虽其无法直接调节间充质干细胞分化,但可以通过激活PI3k/Akt通路来提高TGF-β介导的MEK/ERK通路来提高人间充质干细胞的分化。

    VEGF是由6个同源二聚体蛋白组成的家族,VEGF在体外能够通过剂量依赖性的方式增加碱性磷酸酶活性从而直接推动人原代间充质细胞的成骨分化;同时,VEGF与BMP-2能够共同促进间充质干细胞的归巢和分化。IGF家族主要包括两个多肽生长因子IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ、其各自的细胞膜受体IGF-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)和IGF-Ⅱ受体(IGF-ⅡR)、以及6个可溶性IGF结合蛋白(IGFBP1-6)。在骨生成过程中IGF-1对成骨细胞有招募作用,并且其可以通过β-连环蛋白来促进成骨。

    由此可见,各种生长因子在PRF内都能单独或协同地发挥促进组织修复的作用。除生长因子外,PRF内的炎症因子也发挥着一定的调节作用。IL-1β由巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞等细胞释放,是炎症控制的关键调节因子,其合成受TNF-α、干扰素、细菌内毒素等的调节。IL-1β的主要作用为激活辅助T细胞,同时也能够激活破骨细胞的活动。IL-6是与IL-1β、TNF-α相关的炎症因子,主要来源于激活的单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞。

    研究表明,软骨细胞及成骨细胞被激活后也可以产生IL-6。IL-6可以促进B淋巴细胞分化为浆细胞,同时也可以激活T细胞;其与B淋巴细胞共同存在时可以显著地促进B淋巴细胞抗体的分泌,从而激活免疫反应。TNF-α在细菌内毒素造成的炎症初期被释放,主要由巨噬细胞、单核细胞及中性粒细胞分泌,并可以通过TGF-β调控IL-1、6的表达。IL-4主要由T细胞激活。它可以刺激成纤维细胞分泌胶原纤维,并抑制IL-2β对MMP-1、MMP-3的激活,同时抑制IL-1β介导的炎症通路。

    1.3白细胞

    有研究表明PRF内含有血液成分中65%的白细胞,其在组织愈合时的免疫反应中起着重要作用。炎症反应主要由白细胞迁移至损伤区域而开启,随后白细胞被吞噬能力更强的单核巨噬细胞替代,而淋巴细胞与浆细胞主要参与特异性免疫反应。PRF中检测到的各种炎症因子的来源主要为白细胞。炎症因子存在于纤维蛋白交织的网络中,持续地发挥作用。正因为有这些因子的存在,PRF可以被看作是一个免疫调节的位点。然而其PRF可以被看作是一个免疫调节的位点。然而其具体机制还有待研究。

    1.4干细胞

    最近有学者发现L-PRF中存在造血干细胞,依据是他们探查到CD34阳性。然而CD34阳性的细胞有很多,例如间充质干细胞、内皮祖细胞、间充质树突状细胞,所以PRF内是否存在干细胞,存在的干细胞的种类依然值得探讨。

    2.PRF的分类

    血小板浓缩制品发展至今衍生出不同的种类,但大体分为以下几种。

    2.1P-PRP

    P-PRP为含少量白细胞的富血小板血浆,其制作方法为将少量血液放在离心管内相对离心力为460×g的情况下离心8min得到3层产物,去除上清液和红细胞层后,将剩余产物放置于有氯化钙的收集管内,等待凝结成块,其含有少量的白细胞和少量的纤维蛋白结构。近期研究表明,在相对离心力为160×g的条件下一次离心10min,再在相离心力为250×g的条件下二次离心15min,会比之前报道的P-PRP内含更多的血小板和生长因子。

    2.2L-PRP

    L-PRP为富白细胞的富血小板血浆,其通过两步离心法制成,先样品离心得到三层产物,再将血浆层与棕黄色层再次长时间离心,所得的产物富含白细胞和少量的纤维蛋白结构。

    2.3P-PRF和L-PRP

    P-PRF为含少量白细胞的富血小板纤维蛋白,是将样品血液与抗凝剂与分离胶混合高速下离心6min,后将棕黄色层与血浆层置入氯化钙立即离心约15min,然后得到产物,含少量的白细胞和较多的纤维蛋白。L-PRF作为第二代血小板制品,是不添加任何体外物质的前提下将10mL血液装入收集管,在3000转/min,相对离心力为400×g的情况下进行离心10min而得到,其内含较多的纤维蛋白和高密度的纤维蛋白结构。

    2.4PRF衍生产品

    近期在PRF基础上衍生出许多新的血小板浓缩制品。CGF(浓缩生长因子)是将血液样品在2400~2700r/min的条件下离心得到,拥有更高密度的纤维蛋白。A-PRF为更先进的富血小板纤维蛋白,其制备是将10min血液装入收集管,在3000r/min,相对离心力150×g的情况下离心14min而得到;通过增加离心时间,从而让PRF内含有更多的白细胞及生长因子,并释放更多的BMPs。i-PRF为注射型富血小板纤维蛋白,是将9mL血液样品在不添加任何添加剂的情况下3300r/min离心2min得到,离心管中橘黄色液体即为i-PRF。

    3.PRF的降解

    有学者在PRF膜体外降解的实验中测得PRF膜在1周后减少了36%的质量。而牛胶原膜大概只减少了3%的质量。在另一将PRF制成膜状,浸泡于人工唾液的体外降解实验中,学者发现,降解速度与纤维蛋白含量有关,且含量越高降解速率越慢,膜状较块状降解快。在PRF体内降解的实验中,有学者将PRF膜分为两组,暴露或埋入硬腭软组织缺损处后发现,PRF暴露组10d完全降解,PRF埋入组14d完全降解。

    总体而言,PRF的降解速率主要和其中的纤维蛋白含量及是否暴露于口腔有关,其体内降解速率的具体影响因素仍有待研究。

    4.PRF的功能

    4.1引导硬组织再生

    在对10只兔颅骨骨缺损模型的研究中表明,应用PRF结合牙齿煅烧颗粒相比于单纯的牙齿煅烧颗粒能够加快新骨再生的速度。另有研究表明,使用PRF/Bio-oss复合物植入种植体周围骨缺损处,PRF可以明显加快骨缺损的愈合,同时,PRF还可以通过促进Bio-oss材料对种植体周围骨缺损修复的作用来增强其成骨修复能力。以上研究表明,PRF在与同种或异种移植物联合运用时能够促进移植物在骨缺损处的修复能力。除联合应用外,也有学者探究单独运用PRF在缺损处的修复效果。在对兔颅骨缺损模型的研究后发现,单独充填PRF组成骨效果较空白组更佳。

    又有对犬股骨骨缺损模型的研究表明,单纯充填PRF组较Bio-oss组与自体骨组在3~6个月有更显著的成骨效果。另对36只兔骨缺损模型的研究表明,PRF组的骨成熟速度优于其他组,PRF组在骨缺损处的BMP-2、OPG表达高于其他组,RANKL表达下降趋势快于其他组,表明PRF能够促进成骨分化,并在一定程度上抑制破骨活动。学者猜测其具体机制可能是PRF内的TGF-β1可以促进骨基质的产生和成骨细胞的分化并抑制成骨细胞RANKL的分泌,从而间接地限制破骨细胞形成的能力。

    4.2引导软组织再生

    在对54只兔硬腭前部软组织缺损模型的研究表明,PRF能够加速软组织创面愈合,减少瘢痕形成。PRF对于真皮层成纤维细胞的增殖具有显著的促进作用,它可以促进真皮层成纤维细胞的有丝分裂和迁移,促进软组织重建。同时也有研究发现,PRF可以促进牙龈内成纤维细胞和角化细胞的增殖。在牙周组织中可以发现大量的PDGF受体,PDGF可以作为牙龈牙周膜中成纤维细胞的趋化因子,促使软组织再生。同时,PRF内含大量的VEGF,可以促进血管化支撑软组织的再生,激活血管内皮细胞的有丝分裂及迁移,从而激活组织修复早期的血管化,促进软组织的生成。

    4.3引导神经组织再生

    骨感知指种植义齿在缺乏牙周膜感受器的情况下,下颌运动时通过颞下颌关节、咀嚼肌、骨膜而产生的辨别感觉的能力。故PRF对于神经组织再生的影响值得关注。最近一项研究表明,PRF不仅能促进施旺细胞等增殖、分化,也能恢复神经损伤模型中相关的神经功能。在一项运用PRF进行牙槽位点保存的研究中发现,应用PRF不仅增加了骨厚度及高度,同时也增加了血管化的程度,促进了软组织生成及部分神经纤维等再生。然而PRF对周围神经再生的影响依然存疑,有研究表明PRF对于10mm直径的坐骨神经缺损有修复的效果,但对于5mm的坐骨神经的缺损缺乏作用效果。故PRF对于神经组织再生的影响依然值得进一步探讨,其机制也有待发掘。

    4.4抗菌性

    PRF内的白细胞不仅可以释放生长因子,还能够释放如丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶等蛋白酶。研究表明,丝氨酸激酶可以激活血小板和淋巴细胞,使PRF拥有抗菌性能。在PRF对3种革兰阴性菌的抗菌性研究中发现,PRF能够有效抑制牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌及梭形杆菌的生长,且伴放线放线杆菌对PRF作用最为敏感。另有关于PRF菌性的研究表明,PRF内的白细胞和血小板在PRF的抗菌活动中起着重要的作用。但其具体机制仍有待探讨。

    5.PRF在口腔种植的应用

    5.1拔牙位点保存

    在拔牙位点保存的术式中,运用PRF相比于自然愈合能够增加保存的牙槽嵴高度并且减少颊侧的骨吸取。在对23名成年人进行拔牙位点保存的研究中,实验人员将实验对象分为PRF、PRF+黏膜瓣、空白对照3组。术后8周,显微CT显示单独PRF组的新骨三维结构相比于PRF+黏膜瓣组和空白对照组拥有更高的密度。镜下观察得出PRF组的新骨形成率、骨小梁数、骨小梁厚度均为最高。同时,PRF组生成的新骨具有更高的弹性模量;X线片则显示PRF组有最少的牙槽嵴宽度的缺失。

    研究认为,单独运用PRF进行牙槽位点保存更有利于硬组织的保存。在另一对32例美学区唇侧骨量缺失患者的研究中发现,拔牙后运用PRF进行牙槽位点保存5月后,角化龈宽度增加大约2.3mm,垂直骨高度近中提高(0.8±0.1)mm,远中提高(0.7±0.1)mm。在植体植入后5个月口内观察可见,单独PRF组角化龈宽度增加大约3.2mm。从而得出结论单独运用PRF进行拔牙后位点保存不仅有利于硬组织的修复也有利于拔牙位点上软组织的保存。

    5.2引导骨再生术

    在40例即刻种植的研究中,患者被分为PRF/Bio-oss试验组与单纯Bio-oss组,研究结果表明,PRF/Bio-oss组的新骨密度、厚度、高度均显著高于单纯Bio-oss组,PRF/Bio-oss组的种植体周围成骨效果更佳。在另一研究中学者将PRF覆盖于59例即刻种植的患者的127枚植体表面,修复后30个月CBCT观察发现,近中牙槽嵴顶距邻接点距离为(5.2±0.9)mm,远中牙槽嵴顶距邻接点的距离为(4.2±1.0)mm,高于空白对照组。这些数据表明,运用PRF有助于即刻种植,可以使种植体周围获得良好的骨结合,并且获取稳定的生物学宽度。

    在磨牙区骨缺损的研究中,所有病人受区均有10mm的剩余骨高度和少于4.33mm的唇侧厚度。将24例患者分为两组,第一组在移植骨块表面覆盖PRF,第二组在移植骨块的表面覆盖心包膜,术后4个月锥螺旋CT表明PRF组唇侧牙槽骨厚度恢复5.35mm,而心包膜组唇侧骨厚度恢复5.099mm;同时PRF组的成功率为100%,而心包膜组的成功率为91.67%。因此学者认为,PRF膜较传统心包膜有更好的促进硬组织生成的能力。以上研究表明,PRF能够增加传统引导骨再生术的效果,促进骨再生的成功率及种植体的稳定性。

    5.3上颌窦提升

    在4例运用PRF进行上颌窦提升病例中,研究者在上颌窦提升时运用无机牛骨与PRF混合物作为充填材料,并在侧壁开窗口表面覆盖PRF膜。7~10个月后组织学检查发现,4个病例中新骨形成分别占(31.7±1.2)%,(21.0±1.0)%,(38.0±0.6)%,(47.0±0.6)%;而仅用无机牛骨的新骨形成比例大约占22.9%,这些结果表明无机牛骨联合运用PRF比单独运用无机牛骨效果更好。

    在20例上颌窦提升的研究中发现,术后3个月PRF结合人工骨粉组的人工骨粉降解,新骨形成明显。这表明PRF联合异种移植物能够促进新骨形成,提高新骨质量。在单独运用PRF的研究中,研究人员对6只犬行通过侧壁开窗分离上颌窦黏膜的上颌窦外提升术,并同期植入种植体。实验中植体进入上颌窦6mm,且在分离的黏膜与上颌窦底之间填充PRF。6个月后大体可观察到窦内种植体表面覆盖有一薄层上颌窦黏膜,CT显示上颌窦黏膜与种植体贴合,并且种植体周围与其顶部有骨样组织生成。镜下观察则表明,窦内植体的下半部分有新生骨组织;窦内唇侧生成的骨组织高度约为(2.6±2.0)mm,腭侧新生骨的高度约为(1.3±1.8)mm。学者认为,单独运用PRF能够促进上颌窦内植体周围的新骨形成。

    另有在对12只犬进行上颌窦提升术的研究中发现,PRF组的植体周围新骨形成高度为(3.135±0.288)mm,新骨密度为(65.06±5.88)g/ cm3,表明单独应用富血小板纤维蛋白于上颌窦提升种植中,可以促进种植体周围的新骨形成,但新骨的形成量较自体骨有限。研究最后指出,PRF联合植骨材料的作用明显,但单独运用于上颌窦提升的效果还有待观察。

    6.总结

    如今,PRF在口腔颌面部修复,引导组织再生,种植相关术式中的积极作用已得到了普遍的验证。但单独运用PRF的作用效果仍存在着争议,其作用机制亦存在着疑问。同时,因缺少相关临床病例支撑,PRF对于神经组织再生的影响与机制也尚不明确。总而言之,PRF这一被广泛利用的自体材料,仍旧拥有巨大的应用空间,其内细胞因子的具体作用机制也有待进一步深入的探究。

编辑: 陆美凤

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