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生物抗菌多肽在口腔疾病治疗中的应用

2019-12-3 15:12  来源:口腔颌面修复学杂志
编辑:杨树青 窦丽鑫 王宏远 阅读量:728

    龋病发生的主要因素为病原菌、食物、宿主和时间,而病原菌在牙齿表面定植形成生物膜并且产酸使牙齿脱矿是龋病发生的直接原因。且生物膜结构为细菌提供了抵抗抗菌药物的能力。再有,传统抗生素容易产生耐药性。因此,需要研发新型的能够抑制游离或生物膜状态微生物的药物。以抗菌多肽为原材料来开发替代传统抗生素的新型抗菌药物成为当今研究的热点。

    1.抗菌多肽的种类及生物学特点

    生物抗菌多肽是多细胞生物体在特定外界条件诱导下,自身防御系统通过基因编码、核糖体合成,产生的一类具有高效、广谱抗菌活性的小分子多肽,广泛存在于多种生物体内,从原核生物到植物、动物(包括脊椎动物和非脊椎动物)都可以产生。1980年,瑞典科学家用阴沟肠杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的天蚕素(cecropins)是世界上发现的第1种抗菌多肽。

    随着对抗菌多肽的研究不断深入,多个国家的研究者已建立了十多个抗菌多肽数据库,目前登记有2600多种抗菌多肽。抗菌多肽主要来源及种类如下:

    1.1微生物源

    微生物源抗菌多肽分为细菌源和病毒源两类,细菌源抗菌多肽包括杆菌肽、短杆菌肽S、多粘菌素E和乳链菌肽等,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均可产生;病毒源抗菌多肽主要为人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)及其他慢病毒的跨膜蛋白,具有抗菌活性和细胞毒性。

    1.2植物源

    植物源抗菌多肽包括硫素、植物防御素、脂转移蛋白等在内的8个家族,均含有大量半胱氨酸,并形成2-6个分子的内二硫键稳定其结构,对真菌和植物病原具有很高的抑杀活性。

    1.3动物源

    动物源抗菌多肽种类繁多,从海洋生物到哺乳动物体内均有发现。tachyplesin提取自海洋生物亚洲鲎,可抑制移植性肿瘤的生长;天蚕素是昆虫遭受外界微生物刺激或感染后,由血淋巴产生的一类多肽;水蛙皮肤可产生一类碱性无半胱氨酸抗菌多肽,可杀死细菌,真菌,原生动物,甚至肿瘤细胞,但对体细胞及红细胞无抑制作用;猪上皮β防御素(pBD-1)主要来源于宿主白细胞、吞噬细胞和黏膜上皮细胞。

    1.4人源

    目前在人类细胞中发现的抗菌多肽有defensins、cathecidins、histatins,多在吞噬细胞和粘膜上皮细胞中表达。

    2.抗菌多肽的结构及抗菌机理

    最早得以测序研究的抗菌多肽基因是CecropinB基因,含有一个CAAT框、一个TATA框、一个帽子位点和PloyA加尾信号以及内含子和部分假基因,是一种典型的真核基因。抗菌多肽属于小分子肽,由12-50个氨基酸组成,为两性分子,常带正电荷,N端富含极性氨基酸,C端通常酰胺化,在一定条件下,部分抗菌多肽分子N端易形成α螺旋、中间易形成β折叠的二级结构特征,依据氨基酸序列和二级结构的不同,可分为:α-螺旋型抗菌多肽、β-折叠抗菌多肽、具有环形结构抗菌多肽和伸展性螺旋结构抗菌多肽。

    通过脂质体模拟实验及二维核磁共振谱法对抗菌多肽的二级结构研究得知,二级结构是其攻击病原菌的关键因素。目前抗菌多肽作用机理主要存在以下几种。

    2.1改变细胞膜的通透性破坏菌体渗透压

    部分抗菌多肽分子可通过静电作用和疏水作用与膜结合,并在质膜中聚集、形成跨膜孔洞,从而改变细胞膜通透性并抑杀细菌,其独特的抗菌机制使病原菌无法产生耐药性。抗菌多肽破坏细胞膜的机制有桶-板、地毯、环形孔三种模型,其杀菌过程为①抗菌多肽分子α-螺旋上的正电荷与细菌质膜磷脂分子上的负电荷通过静电吸引靠近并吸附到细菌的细胞膜表面;②疏水α-螺旋插入疏水的细菌细胞膜中央,α-螺旋的两亲性使抗菌多肽分子通过膜内分子间的位移而聚集在一起,多个抗菌多肽分子共同作用形成离子通道;③细菌因渗透压改变死亡。抗菌多肽只对原核生物细胞、最低等的真核生物(酵母)以及某些植物的原生质体有特异的溶菌活性,对正常的哺乳动物细胞无裂解作用。真核细胞质膜表面的膜蛋白和胆固醇、哺乳动物细胞中的细胞骨架系统均可以使细胞膜趋于稳定,抵抗抗菌多肽的溶菌作用。

    2.2抑制细胞壁的形成使菌体生长受限

    人源抗菌多肽(defensin-3)能通过阻止外膜蛋白质的合成,从而抑制细菌形成细胞壁,引起细菌细胞形态异常、胞壁穿孔等。

    2.3作用于线粒体抑制细菌呼吸

    抗菌多肽Psacotheasin可诱导线粒体出现肿胀、空泡化、嵴脱落、膜孔洞形成等现象,使得线粒体内部的凋亡分子释放到细胞质内,菌体因无法进行正常的呼吸作用而死亡。

    2.4作用非膜性外部耙点干扰胞外信号转导

    Attacin可通过干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白的转录从而导致细胞膜的通透性增加,抑制细菌的生长。

    2.5作用细胞内生物大分子干扰细菌胞内信号转导

    抗菌多肽Buforin可不通过细菌细胞膜,直接作用于胞质内的DNA,通过干扰细菌细胞外膜蛋白的转录,发挥抑菌作用。抗菌多肽还可作用于细菌内的内共生体,通过抑制细胞分裂来调节细菌的生长。除此之外,乳铁蛋白的抗菌机制较特殊,铁离子是细菌生物氧化酶所必需的物质,一般认为,乳铁蛋白与Fe3+结合后,使细菌因不能从环境中获取铁离子而无法正常生长。

    3.抗菌多肽的抗菌活性及功能

    抗菌多肽具有分子量较小、热稳定性及生物相容性好、作用机制独特、不易产生耐药性、不易引起机体的不良反应等特点,除此之外,还具有以下多种生物功能:

    3.1广谱抗微生物活性

    抗菌多肽在体外往往表现出广谱且高效的抗菌活性,对多种耐药性的菌株表现出较好的杀菌效果,能有效抵抗对甲氧西林、氨苄青霉素和氟康唑等有耐药性的菌株,对真菌、寄生虫、病毒、原虫以及癌细胞也有抑制或杀灭的作用。

    3.2吸取和利用快速、安全

    抗菌多肽因其分子较小,当机体遭受外界病原菌感染时,能够迅速产生并扩散,在接触病原菌2-3min后可将其杀死,比免疫蛋白和免疫细胞更快、更灵敏。

    3.3抑制细菌生物被膜的生成

    目前已证实多种抗菌多肽分子具有抑制细菌生物被膜生成的功效。据Sánchez报道,来源于人乳铁蛋白的抗菌多肽LF11-215可深入渗透进生物被膜结构并杀死其中的病原微生物。人体中的主要抗菌多肽LL-37能通过控制生物被膜形成时所必需的群体感应基因,抑制细菌黏附聚集到牙齿表面;还可增加生物被膜顶部细菌的表面运动,干扰其生长厚度、促进成熟生物被膜分散。在防治细菌生物被膜的策略中,使用抗菌多肽成为一种方法。

    3.4提高机体免疫力

    在对各种不同的细胞株及实验鼠的研究中证实,抗菌多肽不仅能直接杀灭侵入生物体内的病原微生物,部分抗菌多肽还具有趋化中性粒细胞、增强吞噬细胞的吞噬能力、启动和调节特异性免疫、中和内毒素、促进伤口愈合等多方面的功效,在宿主自体防御机制上扮演着重要的角色。因此,抗菌多肽与传统抗生素相比较具有以下优势。

    ①作用机制独特、不产生耐药性:抗菌多肽与传统抗生素的抗菌机制不同,不是以具体的靶点为目标,而是靶向微生物的细胞,微生物只有改变其细胞膜磷脂双分子层的结构或组成,能抵制抗菌多肽,因此很难产生耐药性。

    ②选择性吸附、不损伤正常人体细胞:细菌胞质膜外面的一层磷脂层带负电荷,动植物或人的细胞质膜外面不带负电荷,当带正电荷抗菌多肽与不同细胞接触时,会选择性地吸附到细菌表面而不至于破坏人体细胞。

    ③抗菌谱广、生物效应广泛:部分抗菌多肽通过破坏微生物细胞膜来杀灭微生物,抗菌谱广;还可抑制细菌生物被膜的生成、调节机体免疫功能等。抗生素一般为抑菌而不是杀菌。

    ④抗菌作用快速、无毒副作用:多肽是由生物体自身合成的小分子多肽类物质,其分解产物为氨基酸,利用吸取快速,无副作用。

    抗菌多肽克服了传统抗生素的局限性,有望成为替代抗生素的新型高效抗菌剂。目前获得生物抗菌多肽的方法主要有四种:从生物体内直接提取内源性抗菌多肽;利用化学合成法合成已知氨基酸序列的抗菌多肽;基因工程法克隆抗菌多肽;酶解法获得抗菌多肽。但此方法在实际生产中存在提取率低、成本高、环境污染、抗菌活性难以保障等缺点,无法对抗菌多肽类药物进行大量、规模化生产。

    4.抗菌多肽制剂在治疗口腔疾病中的应用

    龋病和牙周病是口腔中的两类主要疾病,在全世界有高达60-90%的患病率,而菌斑生物膜中的微生物是致病的主要原因。传统抗生素易诱使微生物发生基因突变而产生耐药性,氟化物防龋也仅在部分人群中推广有效。因此,抗菌多肽类新型药物成为最近口腔微生物学研究的焦点,能抑制以游离或生物膜状态存在的微生物。

    4.1新型优化抗菌多肽pm11对口腔常见微生物杀菌作用

    在口腔唾液中发现的抗菌多肽(防御素)显示出对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌以及各种真菌和病毒均具有抗菌活性。营秀等在抗菌多肽pleurocidin活性中心的基础上设计出氨基酸数量更少的新型优化抗菌多肽pm11,其氨基酸数较少,提高了对细菌生膜的渗透能力。在pm11对口腔常见微生物杀菌作用的实验中,利用激光共聚焦显微镜观察pm11对游离细菌的作用,发现新型抗菌多肽pm11对变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌等8种口腔常见微生物具有抗菌活性,其杀菌效果呈时间和浓度依赖性。pm11的抗菌活性在唾液组和超纯水组无明显差异,溶解于唾液后的多肽pm11可杀灭或抑制致龋微生物。

    4.2生物抗菌多肽牙周凝胶(捷至宁)对于治疗妊娠期龈炎的治疗效果

    妊娠期龈炎是妊娠女性较为常见的口腔疾病并对妊娠过程形成不良影响,加强对妊娠期龈炎的抗炎抗菌治疗是进一步提高女性妊娠安全的有效措施。生物抗菌多肽凝胶是一种新型的抗菌制剂,其有效成分RISE-AP12是由天然氨基酸组成,具有较好的抗菌性能和生物相容性,在口腔内可代谢分解成机体能吸取利用的氨基酸,无副作用产生,而且不易导致牙体着色。有研究显示,采用生物抗菌多肽牙周凝胶治疗妊娠期龈炎后,观察组患者的SBI、PLI得分均低于对照组患者;观察组用药不良反应率为3.7%,对照组则为7.5%。因此,近年来临床上逐渐采用生物抗菌多肽牙周凝胶来进行妊娠期龈炎的治疗。

    4.3生物抗菌多肽液在口腔固定矫治患者牙周健康维护中的效果

    根据以往研究显示,单纯依靠刷牙等机械方法在固定矫治过程中并不能完全控制菌斑,正畸患者通常会使用氯己定、西帕依固龈液等口腔含漱液控制菌斑。但是,氯己定含漱液的长期使用会导致牙龈着色和味觉损害,西帕依固龈液中的中药成分尚不确定,均影响其推广应用。生物抗菌多肽克服传统药物的局限性,在口腔内可代谢分解成机体能吸取利用的氨基酸,生物相容性好。何杉等选择口腔固定矫治患者90例,通过观察牙龈指数、龈沟出血、牙周探诊深度、菌斑指数四项指标证实,发现在口腔固定矫治过程中,生物抗菌多肽液含漱可有效控制菌斑和预防牙龈炎,可作为一种新型的口腔健康护理药物在临床广泛应用。

    抗菌多肽制成的凝胶类药物治疗口腔敏感菌导致的牙周炎症同样效果显著。IantriBiotcs企业正在开发抗菌多肽(lseganan)含漱剂用于治疗口腔炎,体外研究显示该含漱剂能有效减轻口腔炎的症状,减少口腔疼痛、咽喉疼痛。

    综上所述,抗菌多肽因其分子量小、水溶性好、广谱抗菌活性、不产生耐药性、可有效控制菌斑形成等特点,克服了传统抗生素的局限性,在控制口腔微生物方面有确定的临床价值。新型抗菌多肽已制备成多种剂型供临床应用,包括口腔护理液、牙周凝胶、口腔喷剂等,有望成为取代传统抗生素的新药物。目前抗菌多肽药物大规模开发应用主要存在以下问题:

    ①易被水解失活:抗菌多肽属于短链蛋白,易被唾液中的多种酶降解而失去活性。进一步研究抗菌多肽的一级结构和作用时的空间分子结构与生物活性的关系,构建稳定性更好的抗菌多肽,是研制治疗口腔疾病的抗菌多肽类药物的关键所在。

    ②生产成本高:抗菌多肽在生物体内天然含量极少,抗菌多肽的提取、纯化技术复杂,提取量有限且成本昂贵,如何提高抗菌多肽的产量,降低生产成本等是目前抗菌多肽生产实践中的主要难题。

    ③安全性问题:目前为止,国内外对抗菌多肽的研究大多停留在理论研究及摸索阶段,未证实其是否有潜在的致畸性或致癌性等,要真正投入市场并形成规模,还需对其药理、毒理等方面作进一步研究,并进行更多的临床实验研究。

编辑: 陆美凤

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