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牙釉质仿生再矿化的研究进展

2019-11-15 15:11  来源:实用口腔医学杂志
编辑:赵华蕾 楚金普 阅读量:1744

    牙齿的仿生再矿化(biomimetic remineralization)是在天然牙因龋病或其他牙体硬组织疾病而导致牙体硬组织缺损后,根据仿生矿化的原理在脱矿釉质晶体上实现类釉质晶体沉积,并达到与天然釉质相似的形态及功能。牙齿的仿生再矿化包括牙釉质仿生再矿化和牙本质仿生再矿化,两者因发生机制的不同,其仿生机制也有较大差别。本文就牙釉质仿生再矿化的研究进展作一综述。

    1.牙釉质仿生再矿化的理论基础

    牙釉质的发育过程由成釉细胞形态和功能所定义的预保守、分泌、过渡和成熟4个阶段组成。形成釉质精确组织结构的要点不仅是矿化前期成釉细胞的作用,也与被高度控制表达的蛋白质和酶类有关,这些有机细胞外基质成分(如釉原蛋白,釉蛋白,成釉蛋白)均可通过与细胞以及形成的矿物相互作用而发挥功能。关于釉质晶体的结晶过程,目前有经典结晶理论与非经典结晶理论2种假说。

    上世纪九十年代,学者们通过对晶体成核过程中动力学机制的研究推测:结构化的有机表面在有机基质介导的矿物沉积中,可通过界面识别作用降低特殊晶体面和多晶型的成核活化能,从而抑制特殊晶体面矿物成核,并进而促进晶体的定向生长、延长;即经典结晶理论。但该理论仅能用来说明表面结构良好单晶体的继续生长,不适用于晶体在基质时期从无到有的早期发生过程。

    近些年,学者们又根据矿化过程中有机-无机界面结构及其相互作用强度的研究结果,推测早期无定形纳米粒子的转换,可通过聚集物定向调控而产生晶体学定向混合纳米结构;而定向成核和生物矿物的早期生长,则可能是通过无定形相中尺度的转换和分子机制调节而共同完成的,并将其称之为-非经典结晶理论。

    在釉质晶体的发生发展中,非经典结晶理论认为,有机基体与无机过渡相结合形成釉晶体。基于非经典结晶理论,并通过对釉基质蛋白以及晶体矿物形成的研究,学者们提出了釉质形成模型。该模型将基因表达与细胞外蛋白基质的组装联系起来,并根据釉原蛋白的功能性结构,无定形磷酸钙纳米球结构和排列规律,以及体外结晶实验等基础研究结果,推测细胞外基质引导的釉质晶体生物矿化过程为:矿物离子聚集形成矿物成核前体-无定形磷酸钙(amorphous calcium phosphate,ACP),ACP经细胞外基质蛋白稳定后再排列成平行排列的线性链;随后,ACP融合形成针状矿物粒子并互相结合形成束状结晶,从而形成了纳米尺度下的釉质标志性结构组织;待釉质晶体生长至一定长度后,蛋白水解酶便会逐渐水解晶体间的细胞外基质蛋白,以促进晶体增厚、成熟。

    目前对于仿生再矿化机制以及材料的研究方法,大多是基于非经典结晶理论来构造以釉质细胞外基质蛋白和矿物成核前体ACP为主的釉质形成模型,即通过蛋白的超分子自组装、稳定Ca-P簇、引导其排列成线性链的釉质重建机制重建釉质。

    2.釉质仿生再矿化

    2.1釉原蛋白及其衍生物

    2.1.1釉原蛋白

    釉原蛋白(amelogenin)是釉质基质蛋白的主要成分,是釉质发育过程中主要的功能性蛋白,属于内在无序化结构蛋白(intrinsically disordered/unstructured protein family,IDPs)。IDPs是一种通常以非折叠状态存在的蛋白,也能转换成折叠状态,它们的共同特征是与不同分子相互作用时采用不同结构。这种不稳定的构象赋予了釉原蛋白在釉质形成过程中自组装成纳米球的能力,以及与釉基质蛋白、磷酸钙、细胞受体等相互作用的能力。釉原蛋白对釉质组织的棱柱状结构、釉质晶体尺寸的控制以及釉质晶体的定向延长和釉质厚度的调控具有至关重要的作用。

    在早期体外实验中,使用扫描电镜观察到釉原蛋白能够在矿化溶液中生成显微条带状的磷灰石晶体。目前认为,釉原蛋白的N末端与釉质形成阶段的钙磷相互作用,C末端参与引导构成高度有序平行排列的羟磷灰石晶体。釉原蛋白功能端基团和羟基磷灰石(HA)和晶体结合位点的静电吸附作用,是釉原蛋白引导HA晶体再矿化的关键步骤。釉原蛋白N末端的磷酸基团在釉质发生过程中也能够使釉原蛋白发生构象变化,从而影响釉原蛋白与晶体的相互作用。

    LeNorcy等合成了一种釉原蛋白有机替代物—(lecucine-rich amelogenin peptide,LRAP),是釉原蛋白主要功能段剪接形成的多肽,不仅能够代替釉原蛋白发挥作用,其小分子量的特点也避免了其余非功能片段可能存在的免疫原性。Kwak等证明了LRAP能够代替釉原蛋白完成牙釉质仿生再矿化,形成结构相似的类釉质晶体。

    2.1.2多肽

    在牙釉质的仿生再矿化研究中,多肽的出现主要是基于蛋白质的功能片段,通过对功能蛋白片段的人为修正或互相连接,可最终形成具有与蛋白质相似功能的小分子片段。釉原蛋白的自组装机制涉及双极性蛋白的主要结构-釉原蛋白纳米球表面独特的亲水C末端“尾”,被认为是釉质形成过程中能将ACP转化为HA晶体的重要功能基团。

    Li等利用釉原蛋白的亲水C末端氨基酸残基(-Thr-Lys-Arg-Glu-Glu-Val-Asp)和硬脂酸(C18H35COOH)衍生物合成了两亲性寡肽,并证明这种两亲性寡肽具有与釉原蛋白相似的功能,即能够在钙离子和中性溶液环境中自组装成纳米纤维;使ACP在纳米纤维表面沉积,并进而形成相对稳定的纳米-ACP复合前体;通过诱导紧密排列的束状釉质样HA纳米棒在脱矿釉质晶体上沉积,而增强釉质的表面硬度。合成的小分子多肽(P11-4)能在特定环境触发下通过分子间氢键和某些侧链的共同作用,而分层组装形成纤维骨架。

    Kind等研究发现,P11-4虽然能促进釉质表层下矿物质沉积矿化,但其纤维周围重新形成的HA晶体呈切线状排列,形成扇形结构,与天然形成的棱柱状平行排列的HA晶体有较大差别。通过噬菌体表面技术及细菌表面技术将有机和无机表面结合,可以产生无机结合肽,即HA6-1,其可与釉质HA晶体表面紧密结合。Xiao等将釉原蛋白C末端的16个氨基酸和HA6-1通过连接肽结合,产生了一种新型嵌合肽,虽其不具有釉原蛋白及其他多肽的自组装过程,但仍能与釉质HA晶体面结合,同时将ACP转化为釉质样磷灰石晶体并沉积在酸蚀釉质晶体上,从而达到快速仿生再矿化。除釉原蛋白外,在其他来源的蛋白中也有些类型的多肽能与釉质HA表面结合,如唾液磷蛋白和牙本质磷蛋白等。

    富酪蛋白(statherin)是一种小分子量的酸性唾液磷蛋白,具有唾液磷蛋白的典型功能,即通过-抑制磷酸钙盐的沉积,而维持唾液中钙磷离子饱和度的相对稳定。一种基于富酪蛋白N端初始六肽序列的半胱氨酸标记肽,对牙釉质具有很强的吸附能力,Wang等修正了从富酪蛋白中提取的自然序列,使之形成了具有双官能团的多肽—DE-11;实验证实,DE-11能通过富酪蛋白N末端的6氨基酸残基对釉质HA紧密吸附,并通过一个由多个谷氨酸组成的延伸尾部诱导钙离子的再矿化,证明DE-11在体外具有促进HA结晶和人工釉质龋再矿化的潜力。

    此外,学者们还通过大量的基础及临床试验证实,酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptide,CPP)对于早期釉质损伤具有再矿化作用,含无定形磷酸钙ACP的CPP-ACP复合物产品已广泛用于临床试验。但Xiaotong等通过系统性回顾及数据分析,认为目前仍缺乏证据支撑CCP-ACP凝胶对于早期龋坏、正畸后白垩斑的治疗效果优于常规含氟制剂,且含氟CPP-ACP与非氟化CPPACP的应用存在差异。

    2.2细胞外基质类似物

    基于分泌期和形成期的釉基质具有一致的凝胶样形态,Busch首先采用明胶和钙磷离子来模拟类凝胶的微环境,以诱导釉质氟磷灰石在人牙釉质上形成。琼脂是一种非离子型多糖,含有少量的氨基酸,可作为蛋白质和离子的加载-释放系统。Cao等通过氟磷酸溶液在酸蚀后的釉质切片上建立了四层琼脂糖水凝胶钙磷矿化的模型,电镜下观察显示,釉质模型存在沿C轴方向紧密平行排列的氟化羟磷灰石晶体。

    牙釉质基质衍生物(EMD)是细胞外基质的主要组成成分-釉基质蛋白的产物,目前被广泛用于牙周组织再生。琼脂糖加载釉基质衍生物,与钙磷氟等离子共同作用,可再生出致密度、厚度、有序及结晶程度均有提高的棒状氟化HA晶体,再生晶体的弹性模量和显微硬度相比于对照组也有明显提高。

    Ruan等开发了一种含氨基的壳聚糖水凝胶,即釉原蛋白-壳聚糖水凝胶(Amelogenin-Chitosan Hydrogel,CS-AMEL),通过凝胶中釉原蛋白的超分子自组装,稳定钙磷簇,将其排列成线性链,从而达到釉质仿生再矿化的效果,在电镜下观察到新生的柱状HA晶体,且釉质样本的硬度及弹性模量也分别增加了9倍和4倍;该壳聚糖水凝胶还能抑制细菌生长,有效防龋。

    Zaharia等建立了釉基质蛋白和壳聚糖凝胶(CS-EMD)釉质再矿化模型,通过对新生类釉质层纳米形态、钙磷比、晶格参数及显微硬度的分析认为,在CS-EMD系统中,壳聚糖导致了晶体主要的形态学变动和晶格参数的微小改变,并保存了晶体的C轴取向。

    Prajapati等在CS-AMEL系统中引入了基质金属蛋白酶MMP20,发现其抑制了新生晶体间的蛋白堵塞,提高了再矿化类釉质晶体层的机械性能。水凝胶的引入促进了蛋白和多肽等仿生材料的临床应用,不仅使形成的再矿化晶体与原釉质的结合更牢固、结构更致密,同时还实现了在类似细胞外基质的环境中对矿物离子的部分调控能力。但是水凝胶系统完成仿生再矿化所需周期较长,且形成的晶体间残留有蛋白和凝胶,影响了再矿化晶体的机械性能。

    2.3聚合物

    2.3.1合成聚合物

    在许多负责HA矿化的大分子中都存在羧酸和磷酸基团,在特殊的蛋白及生物环境中,这些基团可以形成微晶,对晶体生长分别产生抑制或促进作用。除磷酸丝氨酸和天冬氨酸外,Li等研究证实,谷氨酸和天冬氨酸能够吸附在酸蚀釉质晶体表面,定向排列束状类釉质晶体层。Wang等利用羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan,CMC)的羧基螯合作用以稳定ACP,并同时引入阿伦膦酸盐(alendronate,ALN)和甘氨酸来进行釉质再矿化实验;结果显示,ALN对釉质的特异性吸附能增强矿化剂与牙釉质表面的结合强度,形成定向而有序排列的束状羟基磷灰石晶体。

    2.3.2聚酰胺-胺型树枝状分子(PAMAM)

    PAMAM被称为人工蛋白,PAMAM能够自组装成与釉原蛋白行为相似的纤维条带状结构,Chen等通过在PAMAM上加载羧基基团(-COOH)而形成了PAMAM-COOH聚合物,并在体外酸蚀釉质晶体上形成了排列良好的棒状晶体。Wu等又在PAMAM-COOH聚合物的基础上通过加载酸性官能团ALN而形成了ALN-PAMAM-COOH聚合物,以利用ALN对釉质的特异性吸附作用,增强PAMAM对釉质的结合力;该研究经体外实验发现,在人工唾液中ALN-PAMAMCOOH能诱导HA在人牙釉质晶体表面进行原位再矿化,并可使其显微硬度恢复至原釉质晶体的95.5%;在小鼠口腔内ALN-PAMAM-COOH能诱导HA再生。

    Chen等研究认为,PAMAM还能通过其表面基团的不同,修饰调控HA的大小和形状;此外,使用磷酸二甲酯(dimethylphosphate)修饰第4代PAMAM而形成了低细胞毒性的PAMAM-PO3H2聚合物,经体外实验发现,在人工唾液中,PAMAM-PO3H2能诱导HA形成有序定向排列的HA晶体,且新生晶体多数与原牙釉质表面垂直;动物实验中也获得了类似结果。

    2.3.3壳聚糖(Chitosan)

    壳聚糖是由随机分布的β-(1-4)-D-氨基葡萄糖(去乙酰基)和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(乙酰化)组成的线性多糖。这种可生物降解的、对人免疫系统无毒的物质已经被广泛的用于牙科材料防龋,牙骨整合和骨植入物的生物活性涂层生长以及伤口愈合过程中的杀菌或抑菌作用。

    目前认为壳聚糖主要通过以下几方面促进再矿化:①通过螯合作用稳定钙离子,并进而形成晶体成核位点;②深入表层下病灶区,并与带负电的磷灰石晶体表面结合;③抑制自发性矿物沉淀,有利于形成长期而完整的表层下矿化;④其衍生物可促进非晶体磷酸钙转化成釉质类晶体。

    Arnaud等分析证实,壳聚糖具有抑制牙釉质脱矿的作用,可作为釉质的抗酸屏障;除此之外,壳聚糖还具有向釉质表层下渗透的能力,其浓度为2.5、5g/ml时能够达到釉牙本质界。目前在釉质仿生再矿化领域对于壳聚糖的应用,主要集中于利用壳聚糖形成合成复合物(如模拟磷酸化蛋白作用的磷酸盐壳聚糖Pchi)或将壳聚糖与其他含蛋白的仿生再矿化材料联合使用(如CS-Ame水凝胶,CS-EMD水凝胶等),以达到釉质晶体的仿生再矿化的效果。

    3.小结

    天然牙釉质的形成是一个复杂而又精密的相互作用过程,基于牙釉质的仿生再矿化,为脱矿釉质甚至部分缺损釉质的晶体重建提供了新的思路,并可使新沉积的晶体具有良好的釉质样层次结构和化学性能。无论是釉原蛋白、多肽、细胞外基质类似物,还是PAM-AM、壳聚糖,这些材料在釉质仿生再矿化过程中,都具有几个共同特点:①稳定溶液中的钙磷离子,抑制早期自发沉淀;②能与ACP结合形成纳米聚合物,且对釉质HAP晶体面有高亲和力;③为新生晶体提供成核位点或矿化模板,以控制晶体的有序形成。目前对于釉质仿生再矿化材料是否有效的评定标准,多是通过观察电镜下是否有类似天然釉质晶体的新生晶体定向有序生成。

    目前的仿生再矿化研究大多仍停留在体外实验阶段,因其实验要求高,周期较长,且缺少口腔内复杂生物环境的干预,新形成晶体的致密度、纯度与天然釉质还是有一定差距,在机械性能方面也有所欠缺;对于新生晶体的生长速度、力学性质也缺乏进一步的研究及论证。牙釉质的仿生再矿化,最终目标是能够形成具有天然牙釉质生物特性的釉质晶体。在以后的研究中,仍需大量的临床实验来验证仿生再矿化材料在口腔内环境中的性能及矿化效果。

编辑: 陆美凤

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