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牙源性干细胞及牙髓再生的研究进展

2019-11-20 14:11  来源:中国实用口腔科杂志
编辑:王恒心 王思拓 伍美玲 李蓓 阅读量:1477

    牙髓病及根尖周病是口腔常见病和多发病。虽此类疾病可通过根管治疗或根尖外科手术治疗以去除症状,但无牙髓的牙齿相比于正常牙齿具有易折裂和牙齿变色等问题。通过牙髓再生治疗重建有活性的牙髓是治疗此类疾病最理想的方法。所谓再生,就是指使组织甚至器官丢失、受损的部分重新生长,还原成正常的形态,行使正常的功能。目前,牙髓再生的前沿研究集中在组织工程领域,近年来利用牙源性干细胞再生牙髓的研究取得了很大的突破。

    干细胞是一类具有很强增殖活性和多向分化潜能的细胞,在不同环境的诱导作用下能向其他细胞分化。牙源性干细胞在牙体组织损伤修复方面发挥关键作用,当牙体组织发生炎症或创伤导致干细胞数量不足甚至缺失时,修复将无法进行。这时,体外扩增干细胞可能是补充丢失细胞以促进组织再生的良好来源。由于胚胎干细胞的研究因伦理问题受到诸多限制,所以牙髓再生治疗中的干细胞主要是牙体组织来源的,如牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)、根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,SCAP)、牙囊干细胞(dental follicle stem cells,DFSCs)等。

    1.牙髓组织来源干细胞

    牙髓是一种非矿化组织,由细胞、血管、神经和纤维等组成。牙髓含有不同类型的细胞,如内皮细胞、神经元细胞、成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、成牙本质细胞等。依据来源牙的发育时间进行分类,牙髓组织来源干细胞包括DPSCs和SHED。虽两者来源相同,但在生长速度、分化模式、基因表达谱等方面存在许多差异。

    1.1DPSCs与牙髓再生

    DPSCs是一种由神经嵴细胞迁移分化的外胚层干细胞,具有间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)属性。DPSCs是在口腔及其周围组织中发现的第一种干细胞类型,也是研究最彻底的牙源性干细胞,已被证明具有多分化潜能,可分化为成牙本质细胞、成骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经细胞等。

    DPSCs表达MSC表面标志物,如CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD146等;但不表达造血干细胞标志物,如CD14、CD34、CD45、CD11b等。Stanko等使用蛋白组学比较了人DPSCs与骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)和脂肪干细胞(ASCs)的基因表达谱。研究结果显示,4种类型的干细胞全部表达CD44、CD90、CD105,而无任何一种细胞表达CD34和CD45;BM-MSCs、UC-MSCs和ASCs中所有被评估的基因显示出与DPSCs类似的多基因表达,但DPSCs与BM-MSCs的蛋白表达存在显著差异;另外,DPSCs与另三种类型的干细胞相比,其在体外培养中具有了更强的传代能力。

    这些结果与之前的一份研究报告一致,该报告显示DPSCs具有较高的增殖率,即在成骨培养条件下,与BM-MSCs相比,DPSCs具有更高比例存活的干细胞,且碱性磷酸酶活性也显著升高。此外,DPSCs具有向神经和上皮干细胞分化的特性,提示DPSCs可能特别适用于神经退行性疾病和口腔疾病的细胞基础治疗。DPSCs已被证明可在体外和体内再生牙髓-牙本质复合体样结构。

    Gronthos等首次证明人DPSCs具有分化为成牙母细胞的能力,在他们的研究中,当DPSCs移植到免疫功能受损的小鼠体内时,成功地再生了一种排列着人类成牙本质细胞样的类牙本质结构。随后,在机械和化学处理的牙本质表面培养DPSCs,观察其形成牙本质母细胞样形态,发现其胞浆延伸至牙本质小管内。

    Piva等从人第三磨牙中分离出DPSCs,在体外培养后植入免疫缺陷小鼠体内,30d后观察发现该植入部位出现了矿化组织,血管生成因子的表达也显著增高,这也提示了DPSCs在牙髓再生中的潜能。另外,有学者做过碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)-2促进DPSCs向成牙本质样细胞分化的研究,其将DPSCs与纳米纤维微球复合3D培养,结果显示,培养的DPSCs具有向成牙本质细胞分化的潜能,而经过bFGF-2刺激的DPSCs成牙分化相关基因和成牙分化相关蛋白显著升高。这提示大家通过诱导DPSCs并对其进行基因修饰等操作可更好地引导其向牙髓-牙本质复合体方向分化。

    同时,生物支架和DPSCs的联合应用也推进了牙髓再生的研究进展。到目前为止,各种天然支架(如明胶、自组装多肽、透明质酸等)和合成支架(如聚乳酸PLLA、PCL等)已应用于临床,其提供了一个优化的微环境来引导DPSCs向成牙本质细胞和其他需要的细胞分化。

    DPSCs不仅可用于牙髓再生,还可以用于骨再生。2009年,首个应用DPSCs的临床试验成功开展。该研究将胶原蛋白海绵支架加载的DSPCs植入人第三磨牙拔除部位,修复了下颌骨的缺损,证明DPSCs具有良好的骨再生能力。另外,若在适当的诱导条件下对DPSCs进行预培养,其可能会发挥多分化潜能,在成软骨、成脂肪和成神经分化中有良好的应用前景。

    1.2SHED与牙髓再生

    SHED是从生理性脱落的乳牙牙髓组织中提取的干细胞。乳牙和脐带一样,均可能含有干细胞,这一观点是由Miura等在2003年首次提出的,并认为乳牙中的干细胞具有高增殖率、克隆形成能力和多分化潜能,可分化为成牙本质细胞、脂肪细胞和神经细胞等。已有多项研究将SHED与DPSCs和BM-MSCs进行了性能比较,发现SHED的增殖率高于DPSCs,且经长期培养后,SHED仍可保持其表型。

    Suchanek等将狗的SHED、DPSCs和BMMSCs用于自体下颌骨大型骨缺损的再生研究中,结果表明,SHED可能具有更佳的骨再生及修复骨骼的潜力。这一想法引出了一项类似的研究,该研究系统地比较了人SHED和DPSCs在体外和体内的增殖和分化能力,结果表明与DPSCs相比,SHED在体内模型中增殖速度更快、分化能力更高,产生更多的矿化组织,提示SHED可作为再生医学应用中更合适且更易获得的干细胞来源。

    曾有学者在两种动物模型中进行了SHED牙髓再生的实验,结果显示再生的牙髓中具有成牙本质细胞层、血管和神经。而后开展前期临床试验,试验组进行牙髓再生治疗,即将创伤的年轻恒切牙髓腔内植入两份含有细胞数量为2.0×107个的SHED聚合体;对照组进行常规根尖诱导成形术治疗。结果显示,治疗后12个月试验组相较于对照组,牙根更长、根尖孔更小,牙髓活力与血管数量大致相同。

    值得一提的是,在试验组中出现了1例治疗后牙齿再次外伤的病例,经组织学染色显示再生的牙髓组织中包含成牙本质细胞层、结缔组织和血管,类似于正常牙髓;经免疫荧光染色表明再生的牙髓组织还表达了神经相关蛋白NeuN。此外,为评估SHED植入的安全性,对试验组患者进行了24个月的随访,未发生任何不良反应。该研究提供了初步的实验和临床依据,证明将SHED植入牙髓已坏死的年轻恒切牙髓腔中可促进年轻恒牙的牙根发育和牙髓的三维再生。再生的牙髓组织含有正常的组织结构,如成牙本质细胞层、结缔组织、血管和神经。另外,与根尖诱导成形术相比,牙髓再生治疗的牙根更长、根尖孔更小,说明再生的牙髓组织更好地促进了牙齿的发育。

    2.SCAP与牙髓再生

    根尖牙乳头是一种生长在恒牙根尖顶端的软组织,早期研究推测根尖牙乳头是丰富的干细胞来源。随后,这种干细胞群体的存在被成功地证实,并被称为“来自根尖端乳头的干细胞”或“SCAP”。在未发育完全牙齿的治疗过程中保存这些干细胞可使牙根持续形成直至完成,这也是根尖诱导成形术的生理依据。SCAP表面标记物类似于BM-MSCs和DPSCs,STRO1和CD146阳性表达,CD34和CD45阴性表达,CD24已被鉴定为SCAP的特异性标记物。

    一些研究发现,SCAP可能主要分化为牙本质形成初期的成牙本质细胞,而DPSCs可能主要分化为修复性成牙本质细胞。SCAP与同一牙体组织中的DPSCs相比,其具有更高的增殖率、更强的组织再生能力和更多的STRO-1阳性细胞。此外,其扩增存活率更高,对人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)呈阳性表达,而在DPSCs中hTERT通常为阴性。

    SCAP在适当的体外诱导条件下具有分化为脂肪细胞、成牙本质细胞、成骨细胞的潜能。在小型猪中,移植SCAP和牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)能够生成牙根-牙周组织复合体,对功能性牙再生具有重要作用。此后,又有学者体外培养SCAP与PDLSCs,比较两者牙髓再生、成骨及成牙本质的能力,结果显示SCAP与PDLSCs相比有较强的增殖、成骨及成牙本质能力。因此,SCAP介导的组织再生有望成为牙髓再生的干细胞疗法。

    3.DFSCs与牙髓再生

    牙囊是环绕着成釉器和牙乳头底部的外胚层结缔组织,被认为在牙齿发育和萌出中起着关键作用。基于牙囊细胞可产生牙周膜的报道,人们普遍认为牙囊中含有可分化为牙髓、牙骨质、牙周膜和牙槽骨的干细胞。Handa等率先报道了牙囊中含有DFSCs,并发现在免疫缺陷小鼠体内移植DFSCs后,能够成功生成新的牙骨质组织。

    随后研究发现,在智齿牙根形成时也有类似的DFSCs,在细胞培养过程中表现出快速附着的特性,推测其表面标志物有nestin和notch-1,并具有在体外形成钙化结节的能力。另外,在保留干细胞特性的情况下,DFSCs可持续30次传代;体内植入后,可形成类似牙骨质-牙周膜样结构的组织。牙囊中含有不同来源的干细胞群体,有研究证实在牙囊中存在神经嵴干细胞(neural crest stem cells,NCSCs)和胶质样干细胞,表明牙囊可能成为再生医学临床应用中的自体干细胞来源。

    目前对于DFSCs的研究相对较少,大多集中在牙骨质再生方面,而牙骨质与牙本质的生理相似性提示大家可将DFSCs用于牙髓再生的研究,这也许可以成为未来DFSCs的重要研究方向。

    4.应用前景

    牙源性干细胞的实验研究和临床应用虽有一定的突破,但仍处于初期阶段。目前,牙源性干细胞研究的许多技术问题尚未解决,在以干细胞为基础的临床治疗中,干细胞必须在体外扩增获得足够的细胞数量以达到治疗效果。然而,由于干细胞对环境极其敏感,其功能或活性可能在体外扩增过程中及移植到患者时发生变化。

    移植后的干细胞如何参与损伤或病变组织的修复尚不清楚,它们是为组织再生提供支架或细胞,还是通过营养因子的分泌调节细胞的行为,大家均在积极地探索和研究。牙源性干细胞在自我更新能力、多向分化潜能、有效性和低自体移植排斥反应等方面有着无可比拟的优势,其在口腔组织工程中的应用前景非常广阔。随着科学技术的迅速发展,越来越多的研究将会致力于通过诱导牙源性干细胞并对其进行基因修饰等方法为牙髓组织再生和替代治疗开辟一条新的途径。

编辑: 陆美凤

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