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口腔代谢组学研究

2019-11-27 11:11  来源:国际口腔医学杂志
编辑:李伟 周京琳 阅读量:1025

    代谢组学(metabonomics)是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学。作为系统生物学的一部分,它从代谢终产物的角度,进一步体现了基因、蛋白质在机体内的作用过程。这种技术可以无伤害地观察机体生理、病理状态,动态评价基因、蛋白质及药物的作用效应,故又被称为代谢指纹图。

    代谢组学是以物理学基本原理为基础的分析化学、以数学计算与建模为基础的化学计量学和以生物化学为基础的生命科学等学科交叉的学科。代谢组学是系统生物学研究不可或缺的部分,在疾病分型、药物毒性的评估、植物的基因学研究、食品安全的检测、海洋环境的监测等方面取得了巨大的成功,但在口腔医学研究方面应用较少。代谢组学的概念是英国教授Nicholson及其同事用核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)分析大鼠的尿液后,意识到这可能是生命科学研究的巨大突破,于1999年提出来的。

    代谢组学可以对一个生物系统中所有的低分子量的代谢物质进行全面的、定性的和定量的分析,通过考察生物体系受到刺激(如将某一特定的基因变异或环境变化)后其代谢产物的变化或其随时间的变化来研究生物体系的代谢途径。根据不同的研究对象和目的,可以将代谢组学的研究目的分为4个层次:1)代谢物靶标分析(metabolite target analysis),即对某个或某几个特定组分的分析,在这个层次中,需要采取一定的预处理技术,除掉干扰物,以提高检测的灵敏性;2)代谢轮廓(谱)分析(metabolic profiling analysis),即对少数所预设的代谢产物的定量分析,如对某一类结构、性质相关的化合物(如氨基酸、顺二醇类)、某一代谢途径的所有中间产物或多条代谢途径的标志性组分的分析;3)代谢组学分析(metabonomics/metabolomics),一般是对限定条件下的某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行的定性和定量分析;4)代谢指纹分析(metabolite finger printing analysis),用于描述某种生理状态的代谢类型的集合,对所有代谢产物进行高通量的定性分析,一般不进行定量分析,不分离、鉴定具体的单一组分(如表型的快速鉴定)。

    由于国际上代谢组学在口腔疾病方面的相关文献现在仍较少,随着系统生物学及大数据时代的到来,代谢组学在口腔疾病领域的应用必将迅猛发展。现在已开展的研究内容主要有:口腔鳞状细胞癌及白斑代谢产物方面;口腔微生物群(致龋菌及菌斑)方面;牙周病相关代谢产物方面;唇腭裂相关代谢产物方面;口腔生物材料代谢产物方面等。笔者课题团队从事代谢组学在口腔领域的研究十余年,现将初步研究成果总结如下。

    1.口腔黏膜癌变的代谢标志物的解析

    口腔癌通常在中晚期阶段被确诊,从而造成口腔癌患者的预后差和5年生存率低。口腔癌变不同阶段患者血浆代谢物浓度的变化与患者的生理、病理状态息息相关,因此对口腔癌个体血浆代谢组学进行研究,寻找并确定与口腔癌变发生、发展相关的代谢标记物,将有助于提高口腔癌早期检测的灵敏性和特异性。

    笔者课题团队利用1H-NMR检测正常对照组、口腔白斑组、口腔鳞状细胞癌组3组大鼠血浆中代谢产物的变化,并应用主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)等多种数据分析方法对所获得的血浆1H-NMR数据进行解析,以筛选口腔黏膜癌变各阶段SD大鼠血浆中的代谢标志物。在对肿瘤代谢标志物的筛选研究中,除血浆可以提供生物体的代谢信息外,尿液也常被用于代谢标志物的筛选。相对于血浆而言,尿液样本的获取无痛、无创,样本收集更加简单、方便。

    利用1H-NMR测定大鼠尿液中代谢产物的变化,应用PCA、PLS-DA、方差分析(analysis of variance,ANOVA)、Pearson相关性分析法和代谢途径相关性分析法等多种数据分析方法,对所获得的尿液1H-NMR数据进行解析,以筛选出口腔黏膜癌变各阶段的大鼠尿液中代谢标志物。通过构建SD大鼠从正常口腔黏膜经口腔白斑至口腔鳞状细胞癌整个动态连续的口腔黏膜癌变模型,发现采用PCA和PLS-DA方法分析SD大鼠血浆和尿液的1H-NMR数据可以有效区分处于正常口腔黏膜、口腔白斑和口腔鳞状细胞癌状态的3类大鼠。

    同时发现,SD大鼠从正常口腔黏膜经口腔白斑至口腔鳞状细胞癌的癌变过程中,血浆代谢产物乳酸、脯氨酸、异亮氨酸和天冬氨酸等小分子代谢产物可能是监测口腔黏膜癌变过程发生、发展的代谢标志物,在口腔癌的早期诊断与预警中具有一定意义,而胆碱、葡萄糖、缬氨酸、二羟基丁酸的变化可能具有辅助意义。而尿液代谢产物葡萄糖、1-甲基组氨酸浓度逐渐升高,N-乙酰-L-天冬氨酸、3-氨基异丁酸、胆碱、茶碱等小分子代谢产物浓度逐渐降低,这些分子可能揭示了癌变过程的代谢标志改变。

    2.口腔微生物代谢标志物解析

    代谢组学的检测方法操作简单并易获得微生物整体细胞功能的信息,加上快速的自动分析鉴定系统,在微生物领域有很好的应用前景。笔者课题团队开展了将代谢组学方法用于口腔致龋菌的研究,摸索了符合核磁共振仪测试要求的细菌培养方法和代谢组学研究的实验方法,但目前有关口腔致龋菌代谢组学研究不够系统、深入,对细菌属内和属间的代谢差异、样本的制备及对致龋菌毒力基因功能的代谢组学分析所蕴藏的生物学意义还缺乏进一步的认识。

    将基于1H-NMR的代谢组学方法应用于变异链球菌、血链球菌、嗜酸乳杆菌和口腔常见放线菌(内氏放线菌和衣氏放线菌)的鉴定,检测不同口腔细菌的细胞外代谢产物,发掘各种细菌的特征性代谢谱图,探讨代谢组学在口腔细菌鉴定中的作用。PCA显示,各组数据内部都有集中的聚类关系,可以很好地区分这些细菌。

    尝试采用基于1H-NMR的代谢组学方法对变异链球菌UA159野生型菌株和psm突变株的细胞外及细胞内代谢产物进行分析比较,寻找其标志性代谢产物,为深入探讨毒力基因psm功能的研究提供切入点。分析了野生型变异链球菌UA159与srtA基因缺陷型变异链球菌UA159的细胞外代谢产物之间的差异,发现大多数有差异性的代谢产物是未知的,可识别的差异性代谢产物有亮氨酸、缬氨酸、乳酸、酮戊二酸和甘氨酸。

    3.唇腭裂畸形的代谢标志物解析

    先天性唇腭裂是在遗传、环境和母体等多因素作用下发生的口腔颌面部最常见的、严重危害母婴身心健康的疾病。其发生时段主要在腭胚突的生长发育、运动期和两侧腭胚突的接触、黏附融合期。母体环境变化是腭裂发生、发展的关键环节,母体对有害物质或保护性药物的代谢能力具有重要作用。建立代谢特征产物分类模式模型,并对其特征代谢产物进行分析,不仅可以通过检测母体代谢环境改变来探测胚胎发育异常变化,而且可以在胚胎发育过程中进行全程检测,可以完整描绘在腭胚突发育期间母体代谢轮廓,从母体代谢产物的层面间接反映了腭胚突发育的变化。

    笔者课题团队通过以腭裂非易感C57BL/6J孕鼠为模型,运用代谢组学手段,针对致畸剂地塞米松作用及腭胚突发育特点的分子理论基础,从体内及体外、纵向及横向几个方面进行研究,成功描绘出在腭胚突融合过程中母体代谢特征指纹图及体外培养的培养液的代谢指纹图。结合化学计量学的模式识别分析技术,建立了判别代谢异常的拟合模型,并可以通过相关分析及变量重要性分析甄别出关键异常代谢物质。成功地从机体代谢角度阐述了腭胚突发育的机制,为进一步深入研究腭裂发生机制提出新思路。

    采用代谢组学方法研究,使用维生素B12阻抑本已诱发的唇腭裂发育早期过程的变化机制。方法是选取对照组和实验组各12只怀孕17.5d的C57BL/6J雌鼠,一组仅注射维生素B12,另一组注射维生素B12后再注射过量地塞米松,观察维生素B12对腭裂发生率的影响。利用NMR技术检测血浆内源性小分子代谢产物,通过PCA方法确定代谢产物成分的变化。结果发现2组腭裂是否发生与PCA得分散点图有显著的差别。认为代谢组学方法可以用于进一步深入探索唇腭裂的发病机制、维生素B12参与阻抑唇腭裂的代谢机制。

    笔者课题团队对代谢组学技术在非综合征性唇腭裂患者的临床应用可行性进行了探讨。分别收集非综合征性唇腭裂患者和正常人的血浆,通过NMR和PCA获得非综合征性唇腭裂患者与正常人的血浆代谢产物谱的差异,发现至少有3种不同的代谢产物(分别为三羟丁酸γ甲基类物质、精氨酸和缬氨酸)与非综合征性唇腭裂发生有关,患者血浆代谢产物以缬氨酸和三羟丁酸γ甲基类物质为主,而正常人血浆代谢产物则以精氨酸为主。

    4.口腔生物材料的代谢标志物解析

    口腔生物材料广泛应用于口腔临床疾病的治疗,种类繁多。不同的生物材料的生物相容性、细胞毒性各有差别。组织、细胞与不同的生物材料接触并附着生长,生物相容性较差的材料势必对生物体系的生长代谢产生不同程度的影响。由于生物体的代谢极易受外界环境、疾病等压力因素扰动,代谢物的种类、含量等发生变化。检测不同环境中的细胞外培养液,对体外培养细胞进行代谢组学分析,在一定程度上可以更为直接和准确地探查细胞与材料之间的作用结果和机制。

    笔者课题团队尝试采用代谢组学的实验方法探究生物相容性,不仅可较大程度缩短检测的时间,更便于探寻材料对细胞生长的即时作用,这一点可以弥补传统生物相容性判定方法实验周期较长的局限性。作为探索研究,选择了3种常见的、生物相容性水平已被公认的口腔生物材料钛、羟磷灰石-磷酸三钙生物陶瓷、聚甲基丙烯酸甲酯作为研究对象。聚甲基丙烯酸甲酯的生物相容性次于其他2种口腔生物材料(钛、羟磷灰石)。主要研究目的是探讨代谢组学方法是否可用来反映和判断材料生物相容性。运用1H-NMR代谢组学的方法检测了上述3种不同口腔生物材料的细胞培养液,通过即时测定和多元统计学分析,最大限度地了解短时间内生物材料对细胞生存微环境的影响。

    通过确定25种特征性代谢产物及相关通路,在一定程度上良好地区别了3种生物材料的生物相容性;通过代谢通路分析,推测聚甲基丙烯酸甲酯生物相容性欠佳可能影响到了成骨细胞的糖代谢过程,间接刺激了脂质代谢的增多,这可能是造成聚甲基丙烯酸甲酯组细胞外代谢通路区别于钛、羟磷灰石-磷酸三钙生物陶瓷组的部分原因。检测结果显示了与传统生物相容性分析结果的一致性,表明通过代谢组学分析可以良好地反映出材料的生物相容性,并可利用其对材料导致的细胞代谢干扰机制进行分析,具有一定的应用前景。

编辑: 陆美凤

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